: : Разделы сайта : :
Какой фестал лучше обычный или кишечнорастворимый
: : Календарь : :
: : Архивы : :
: : Пустой блок : :

Обратная связьСвязь с администрацией

Исследуемый материал при микоплазменном артрите

Введение к работе

Актуальность темы. Теломераза представляет собой фермент, который осуществляет наращивание теломерных районов хромосомной ДНК. Известно, что укорочение теломерных районов ДНК до значений, являющихся критически малыми, может служить сигналом к репликативному старению соматических клеток и дестабилизации их хромосом [Chan S.R.W.L., 2004]. Активность теломеразы в совокупности с длиной теломер отражает пролиферативный потенциал клетки. Существуют данные, свидетельствующие о присутствии определяемой активности этого фермента не только в стволовых, половых и опухолевых клетках, но и в слизистых клетках кишечника и в лимфоцитах периферической крови (ПК) и тимуса [Osterhage J.L., 2009], кроме того, каталитическая субъединица теломеразы (hTERT), являющаяся РНК-зависимой ДНК полимеразой, синтезирующей теломерные повторы, а также мРНК этой субъединицы, также экспрессируются в этих клетках на сравнительно низком, но детектируемом уровне.

В течение жизни в лимфоцитах периферической крови происходит постепенное укорочение теломер. Причиной этого являются клеточные деления, накапливающиеся с возрастом in vivo [Osterhage J.L., 2009]. Показано, что при многих, в том числе иммунопатологических, болезнях (ревматоидный артрит, атопический дерматит, бронхиальная астма и др.) лимфоциты периферической крови характеризуются укороченными теломерами и повышенной пролиферацией по сравнению с аналогичными показателями в лимфоцитах здоровых людей. Кроме заболеваний различного генеза, на скорость укорочения теломер в лимфоцитах могут влиять и многие другие факторы, как, например, наличие хронического стресса [Georgin-Lavialle S., 2010].

Установлено, что экспрессия теломеразы в лимфоцитах строго контролируется в течение их развития, дифференцировки и активации [Georgin-Lavialle S., 2010]. Известно, что в результате стимуляции зрелые лимфоциты становятся способны экспрессировать теломеразу на довольно высоком уровне, причем после любой повторной стимуляции экспрессия теломеразы также может возрастать, но ее уровень уже не достигает уровня ответа на первичный стимул [Akbar A.N., 2007]. Такая динамика может отражать механизмы регуляции клональной экспансии лимфоцитов, являющейся частью иммунного ответа, на уровне контроля их пролиферации.

Помимо активации теломеразы существует механизм удлинения теломер, альтернативный теломеразному (ALT -alternative lengthening of telomeres). Тем не менее, наличие этого механизма в клетках млекопитающих в настоящее время обнаружено только в аномальных ситуациях, таких как злокачественные клетки, иммортализованные клеточные линии, и нокаутные по гену теломеразы мышиные клеточные линии, тогда как нормальные лимфоциты человека не обладают способностью использовать ALT для поддержания теломер [Muntoni A., 2009]. Таким образом, основным механизмом стабилизации длины теломер в лимфоцитах является активность теломеразы, и поскольку пролонгирование клональной экспансии крайне важно для функционирования лимфоцитов, они задействуют этот механизм для того, чтобы снизить (но не предотвратить целиком) сокращение теломер в течение пролиферации [Kashubowska L., 2008]. Так, в интактных лимфоцитах при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, рассеянном склерозе и атопическом дерматите активность теломеразы увеличена [Klapper W., 2004]. Показано также, что активность теломеразы способна возрастать в результате острого психологического стресса [Epel E.S., 2010].

Многочисленные данные свидетельствуют, что при большинстве перечисленных ситуаций (иммунопатологические заболевания, стресс и многие другие) теломеры в лимфоцитах, несмотря на повышенную активность теломеразы, сокращаются с возрастом быстрее, чем у здоровых доноров, и немногие свидетельства сохранения длины теломер в лимфоцитах при патологических состояниях являются, скорее, исключением. Таким исключением, например, является отсутствие ускоренного укорочения теломер при бронхиальной астме (БА) смешанного генеза, при том, что при атопической и инфекционно-зависимой БА теломеры укорачиваются с возрастом значительно быстрее, чем у доноров [Борисов В.И., 2009].

Учитывая, что регуляция активности теломеразы контролируется как на уровне транскрипции гена hTERT, так и механизмами посттранскрипционной и посттрансляционной модификации [Ly H., 2009], представляет интерес изучение не только экспрессии мРНК hTERT в лимфоцитах, но и наличия в них самого белка hTERT. Исследование изменений продукции теломеразы на уровне мРНК и белка ее каталитической субъединицы, таким образом, представляет значительный интерес, поскольку может помочь объяснить причину укорочения или сохранения длины теломер при иммунопатологических процессах.

Для количественной оценки мРНК hTERT обычно используют RT-PCR или Northern Blotting. Эти методы недостаточно информативны, поскольку необходимость разрушения клеток для выделения мРНК не позволяет одновременно охарактеризовать исследуемый материал по другим параметрам (к примеру таким, как субпопуляционная принадлежность или экспрессия интересуемых белков) без дополнительного использования методов их сепарации. Этот недостаток отсутствует в методе Flow-FISH, позволяющем оценивать содержание исследуемой ДНК или РНК на уровне единичной клетки с помощью внутриклеточной in situ гибридизации зонда, меченого флуорохромом, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре. Представляется перспективным таким образом модифицировать метод Flow-FISH для выявления мРНК hTERT, чтобы это позволило с достаточной информативностью и высокой производительностью определять экспрессию теломеразы в исследуемом материале.

Цель исследования. Исследовать изменения активности теломеразы в лимфоцитах человека при иммунопатологических заболеваниях аутоиммунного и аллергического генеза на уровне продукции мРНК и белка hTERT и оценить влияние этих изменений на динамику длины теломер.

Задачи исследования:

  1. Изучить информативность, эффективность и особенности применения метода Flow-FISH при определении относительного количества мРНК hTERT в иммунокомпетентных клетках.

  2. Исследовать динамику экспрессии hTERT и мРНК hTERT в CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах человека в условиях поликлональной стимуляции.

  3. Изучить уровень спонтанной и индуцированной экспрессии hTERT и мРНК hTERT в лимфоцитах человека при ревматоидном артрите, атопическом дерматите, бронхиальной астме и апластической анемии.

Научная новизна. Показано, что уровень мРНК hTERT в лимфоцитах периферической крови человека достаточно высок для достоверной ее оценки путем in situ гибридизации с флуоресцентным зондом, специфичным к последовательности этой мРНК, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре.

Обнаружено, что после трех суток поликлональной стимуляции лимфоцитов здоровых доноров в культуре in vitro экспрессия в них мРНК hTERT достоверно повышается. Такое повышение происходит за счет клеток, находящихся в S/M/G2 фазе клеточного цикла (пролиферирующих клеток), тогда как в состоянии покоя (фаза G1/G0) как стимулированные, так и интактные клетки экспрессируют равные уровни мРНК hTERT. Содержание hTERT в лимфоцитах также достоверно возрастает в результате их стимуляции in vitro, более того, между содержанием hTERT в интактных и стимулированных лимфоцитах существует статистически значимая положительная корреляция.

Выявлено более высокое содержание мРНК hTERT в CD8 лимфоцитах пациентов с ревматоидным артритом по сравнению с группой доноров. Тем не менее, содержание hTERT в группе пациентов с РА не отличается от доноров ни в общей популяции лимфоцитов, ни в CD4 и в CD8 субпопуляциях.

Впервые исследовано содержание hTERT и ее мРНК в лимфоцитах пациентов с бронхиальной астмой. Полученные данные свидетельствуют, что в отличие от группы доноров, экспрессия мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах пациентов с БА повышена по сравнению с исходным (спонтанным) значением независимо от стадии клеточного цикла (G1/G0 и S/M/G2). Кроме того, для пациентов с БА смешанного генеза характерно повышение содержания каталитической субъединицы теломеразы в лимфоцитах после трех суток поликлональной стимуляции по сравнению с группой доноров.

Обнаружено, что в лимфоцитах пациентов с атопическим дерматитом, стимулированных поликлонально в течение трех суток, уровень мРНК hTERT, в отличие от доноров, не повышается. Также у пациентов с АД отсутствует корреляция между содержанием hTERT в интактных и стимулированных лимфоцитах.

Научно-практическая значимость работы. Модификация способа определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) обладает высокой производительностью и позволяет с достаточной информативностью определить мРНК hTERT в исследуемом материале (Flow-FISH). В данной методике окрашивание мРНК hTERT на уровне единичных клеток производится в суспензии фиксированных клеток с помощью гибридизации in situ, после чего следует анализ образца на проточном цитофлуориметре. Методика опубликована в виде патента «Способ определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) как показателя уровня активности фермента» и в статьях.

Данные об измененной экспрессии и/или способности к индукции hTERT и мРНК hTERT в лимфоцитах при таких патологиях, как ревматоидный артрит, атопический дерматит, бронхиальная астма и апластическая анемия, дают объяснение феномену ускоренного укорочения или, наоборот, сохранения длины теломер, наблюдаемое в различных субпопуляциях лимфоцитов при этих заболеваниях.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Модифицированный метод Flow-FISH позволяет определять содержание мРНК каталитической субъединицы теломеразы в иммунокомпетентных клетках с помощью гибридизации in situ с флуоресцентным PNA зондом и последующим анализом суспензии клеток на проточном цитофлуориметре.

  2. Повышение экспрессии мРНК hTERT, наблюдаемое при поликлональной стимуляции лимфоцитов, достигается за счет клеток, находящихся в фазе S/M/G2 клеточного цикла, в то время как клетки, находящиеся в фазе G1/G0, экспрессируют мРНК теломеразы на одинаковом уровне независимо от того, были ли они выделены из интактных или стимулированных в культуре лимфоцитов.

  3. Повышенная активация hTERT в Т-лимфоцитах периферической крови обеспечивает сохранение длины теломер при иммунопатологических состояниях, как показано в случае бронхиальной астмы смешанного генеза, в то время как при нормальной или сниженной экспрессии теломеразы возникает ускоренное укорочение теломер (при ревматоидном артрите, атопическом дерматите и апластической анемии).

Апробация результатов. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на 7-ой отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» (г. Новосибирск, 2006), на научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (г. Омск, 2007, г. Красноярск, 2010), на Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008), на школе 3rd ENII-MUGEN summer school in advanced immunology (Alghero, Italy, 2008). Апробация диссертации состоялась 25 мая 2010г. на семинаре НИИ клинической иммунологии СО РАМН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 120 страницах машинописного текста, включающего 12 таблиц и 33 рисунка. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 182 литературных источника, в том числе 171 зарубежных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей учёной степени кандидата наук, и 1 патент.

Источник: http://www.dslib.net/klinika-allergia/jekspressija...

  • Раздел: Антихрап |
  • Автор: Therocks
  • Комментариев: 13
  • Просмотров: 545 |